有關(guān)物質(zhì)的研究貫穿于藥品研發(fā)過程的始終，是評(píng)價(jià)藥物的安全性、仿制藥與原研上市產(chǎn)品質(zhì)量一致性的重要指標(biāo)。目前最常用的方法是高效液相色譜法（HPLC）法。與常規(guī)產(chǎn)品檢驗(yàn)不同的是，藥品研發(fā)中的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的目的，除了將結(jié)果與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度相比以判斷產(chǎn)品合格與否之外，更多是用于處方工藝選擇、藥物雜質(zhì)譜的分析，穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)等，需要特別強(qiáng)調(diào)雜質(zhì)數(shù)據(jù)之間的“對(duì)比”，關(guān)注的是雜質(zhì)的變化量和變化規(guī)律，因此雜質(zhì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、重現(xiàn)、連貫顯得尤為重要。
北京色譜級(jí)正戊烷彪仕奇從對(duì)有關(guān)物質(zhì)的色譜條件設(shè)計(jì)和測(cè)定操作兩方面的影響因素進(jìn)行分析，探討采取可行的方法，最大程度地減少誤差，提高有關(guān)物質(zhì)測(cè)定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、可比性，提高藥品研發(fā)中雜質(zhì)研究的質(zhì)量。
一、基線與溶劑峰
梯度洗脫因其具有在較短時(shí)間內(nèi)有效分離極性相差懸殊的系列物質(zhì)、改善峰形、提高檢測(cè)靈敏度等優(yōu)勢(shì)，而在雜質(zhì)研究中廣為應(yīng)用，呈現(xiàn)出逐步取代等度洗脫的趨勢(shì)。但基線波動(dòng)或漂移是梯度洗脫中常見的問題，基線波動(dòng)產(chǎn)生不確定的微小噪音信號(hào)，疊加在雜質(zhì)峰中，會(huì)使雜質(zhì)“增大”。此外，梯度洗脫易在每一針運(yùn)行的中后部產(chǎn)生溶劑峰，并且毎針之間溶劑峰的大小還不易重現(xiàn)，這將導(dǎo)致在該保留時(shí)間范圍內(nèi)出峰的雜質(zhì)被掩蓋，且無法采取扣除溶劑峰的辦法解決。而等度洗脫因洗脫強(qiáng)度始終保持一致，很少出現(xiàn)上述問題。引起基線波動(dòng)與溶解峰的原因與以下因素有關(guān)。
試劑的純度，試劑中的雜質(zhì)與污染物，會(huì)隨著梯度中的有機(jī)相比例的增大，先富集在柱頭后被洗脫出來，因此配制流動(dòng)相所用試劑應(yīng)采用HPLC級(jí)別或高純度的試劑，并在開瓶后妥善貯存，避免污染。
流動(dòng)相使用時(shí)間，配好水浴緩沖鹽溶液易受微生物污染，同樣產(chǎn)生上述問題，故純水洗流動(dòng)相應(yīng)新配新用，一般使用時(shí)間不應(yīng)超過48h。
流動(dòng)相的配制方法，為方便起見，操作者用用A為純水相，B為純有機(jī)相，由色譜泵進(jìn)行混合形成梯度。這樣有可能因兩性差異大，在線混合時(shí)產(chǎn)生微小氣泡造成基線波動(dòng)，此時(shí)應(yīng)換為A相配成梯度的起始濃度，B相配制成梯度最終濃度，再換算并調(diào)整梯度時(shí)間表使之與梯度相同，因兩相均同時(shí)含有水相與有機(jī)相，混合時(shí)相容性會(huì)更好，基線會(huì)更加平穩(wěn)。
上一針沒完全洗脫的雜質(zhì)干擾，這種情況下，通常發(fā)現(xiàn)在本次運(yùn)行中，形成明顯較寬的“鬼峰”，因此在梯度設(shè)計(jì)時(shí)，流動(dòng)相應(yīng)達(dá)到足夠的洗脫能力，運(yùn)行時(shí)間應(yīng)足夠長，保證雜質(zhì)在每一針內(nèi)能被全部洗脫。
梯度的重現(xiàn)性，梯度的起始流動(dòng)相比例與終點(diǎn)不同，而系統(tǒng)因死體積的存在會(huì)產(chǎn)生“滯后”效應(yīng)，并非在所設(shè)的時(shí)間立即能達(dá)到對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相比例，因此在每一針之后，必須運(yùn)行一個(gè)“倒梯度”回到起始比例，并平衡5min，才能保證梯度的重現(xiàn)性。最好的做法是將這一部分“倒梯度”直接設(shè)計(jì)色譜條件的梯度時(shí)間表內(nèi)。
二、進(jìn)樣設(shè)計(jì)與操作
進(jìn)樣量，進(jìn)樣量是進(jìn)樣濃度與進(jìn)樣體積的乘積。進(jìn)樣量決定了信號(hào)的高低，從而影響靈敏度。進(jìn)樣量決定了信號(hào)的高低，從而影響靈敏度。因?yàn)檫M(jìn)樣體積過大易引起色譜峰的展寬甚至變形，對(duì)低濃度信號(hào)幫助不大，所以通常設(shè)計(jì)5~20ul。故在色譜條件設(shè)計(jì)中，進(jìn)樣濃度決定了檢測(cè)的靈敏度，雜質(zhì)的信號(hào)越高，受到基線噪音波動(dòng)的影響程度就越小，而與檢測(cè)限接近的雜質(zhì)，顯然稍有基線波動(dòng)，其值的相對(duì)變化量較大。
根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則的要求，最低檢測(cè)限不得大于該雜質(zhì)的報(bào)告限度，有關(guān)物質(zhì)進(jìn)樣最低濃度應(yīng)設(shè)定為：檢測(cè)限對(duì)應(yīng)的主成分濃度除以報(bào)告限。
需要注意的是，供試品濃度并非越高越好，過于大的進(jìn)樣量，會(huì)影響主成分與相鄰雜質(zhì)的分離度，產(chǎn)生峰拖尾變形、色譜柱過載等問題。同時(shí)還有考慮所設(shè)計(jì)的高濃度下，主成分是否能夠溶解完全。
為了方便操作，許多質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)中偏好將有關(guān)物質(zhì)與含量測(cè)定共同用一份供試品濃度。但是，由于雜質(zhì)檢測(cè)的目標(biāo)是雜質(zhì)，而含量測(cè)定的對(duì)象是主成分，兩者的量相差達(dá)2~3個(gè)數(shù)量級(jí)，共同的結(jié)果是：或者達(dá)不到雜質(zhì)測(cè)定的靈敏度，或者主成分含量測(cè)定的濃度過大，線性關(guān)系不好，損害柱子的壽命。因此，將有關(guān)物質(zhì)與含量共同一個(gè)供試品是欠妥的。
事實(shí)上，靈敏度在不同的色譜儀器上會(huì)有差異，更為科學(xué)的做法是在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)設(shè)計(jì)靈敏度測(cè)試，同時(shí)允許調(diào)整進(jìn)樣量達(dá)到雜質(zhì)檢測(cè)要求的靈敏度。
進(jìn)樣濃度的一致性，對(duì)于一般檢測(cè)，沒有必要也做不到每份樣品的濃度絕對(duì)一致，允許稱樣量在±10%甚至更寬范圍變動(dòng)，這也是方法學(xué)驗(yàn)證中設(shè)定“范圍”的目的。在有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)中，由于積分時(shí)設(shè)定了報(bào)告限（最小峰面積），有些雜質(zhì)的量剛好就在報(bào)告限（假設(shè)為0.05%）附近，如果稱樣量稍小一點(diǎn)，峰面積剛好在設(shè)定的最小峰面積之下，該份樣品就“未檢出”該雜質(zhì)，如果稱樣量稍大一點(diǎn)，該雜質(zhì)峰就剛好能夠被積分（其值為0.05%），這樣就會(huì)導(dǎo)致即使是同一個(gè)均一樣品，其雜質(zhì)數(shù)據(jù)從0到0.05%沒如果數(shù)個(gè)單一雜質(zhì)都如此，總雜質(zhì)量也會(huì)有明顯的變化。因此，為保證新藥研發(fā)中有關(guān)物質(zhì)數(shù)據(jù)的可比性，供試品的稱樣量不能過于隨意，應(yīng)盡量保持在較小的范圍內(nèi)，如±2%。
進(jìn)樣順序，高濃度樣品運(yùn)行完成后，常會(huì)在系統(tǒng)中有殘留。按有關(guān)物質(zhì)操作要求，每一份樣品通常是先進(jìn)主成分1%自身對(duì)照溶液，再取供試品進(jìn)樣，到下一份樣品又先進(jìn)對(duì)照液，如此高低濃度地往復(fù)循環(huán)，低濃度的自身對(duì)照溶液常易受到前一針高濃度樣品殘留的干擾，峰面積變大，導(dǎo)致雜質(zhì)計(jì)算結(jié)果偏低。
異常情況，每天開機(jī)運(yùn)行的第一針供試品常會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)偏高的異常情況，原因不明。應(yīng)運(yùn)行多次空白梯度后再進(jìn)樣，如果仍有這種現(xiàn)象，應(yīng)與后面的平行樣品對(duì)比后，舍去該針數(shù)據(jù)。
三、積分與色譜圖處理
積分參數(shù)選取不當(dāng)，會(huì)漏掉一些雜質(zhì)峰，或?qū)⑽⑿〉幕€波動(dòng)或漂移計(jì)入雜質(zhì)的面積中，造成雜質(zhì)數(shù)據(jù)的變化，直接影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
初始積分參數(shù)為斜率、峰寬、最小峰面積與最小峰高。對(duì)峰面積大小有實(shí)質(zhì)影響的積分參數(shù)是斜率與峰寬，斜率越大，峰的起落點(diǎn)越高，峰面積越小，反之亦反；峰寬通常設(shè)為所需的最窄峰的半高峰寬，過小會(huì)將噪音視作雜質(zhì)峰，過大易使相鄰的兩小峰合并視為同一個(gè)峰積分。而最小峰面積與最小峰高為過濾性參數(shù)，即低于其值的峰不被積分，因此最小峰面積應(yīng)設(shè)為雜質(zhì)報(bào)告限所對(duì)應(yīng)的峰面積。
選定合適的積分參數(shù)后，應(yīng)固化積分方法，由色譜工作站自動(dòng)進(jìn)行圖譜處理。但如果個(gè)別雜質(zhì)仍由于偶然的基線波動(dòng)或其他干擾明顯積分不當(dāng)時(shí)，采取手動(dòng)方式調(diào)整積分的做法也是必要的。
四、色譜系統(tǒng)
色譜柱，在新藥研發(fā)過程對(duì)于有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，在選擇了分離效果最合適的色譜柱后，應(yīng)固定專用于該項(xiàng)目，更換新柱時(shí)也應(yīng)選擇同一品牌的同一型號(hào)，否則，雜質(zhì)峰的位置不易對(duì)應(yīng)，自然也不利于雜質(zhì)的對(duì)比。色譜柱在使用一段時(shí)間后，分離性能下降，有可能會(huì)將原沒超過最小積分面積的兩個(gè)緊鄰小雜質(zhì)合并為一個(gè)峰，從而被積分，從數(shù)據(jù)上看會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)增加的現(xiàn)象，解決方法是清洗活化色譜柱，如不能恢復(fù)，則應(yīng)更換新色譜柱。
洗針液，某些色譜儀的洗針液是重復(fù)使用的，如此產(chǎn)生的微量殘留，對(duì)于常量檢測(cè)的影響微不足道，但會(huì)明顯干擾微量的雜質(zhì)檢測(cè)，因此需要經(jīng)常更換新鮮的洗針溶液。
北京色譜級(jí)正戊烷彪仕奇認(rèn)為藥品的質(zhì)量來源于設(shè)計(jì)與生產(chǎn)過程，同樣，雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果的“質(zhì)量”也來源于分析方法的合理設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)過程的嚴(yán)謹(jǐn)操作。為得到準(zhǔn)確、重現(xiàn)的雜質(zhì)研究數(shù)據(jù)，藥品質(zhì)量研究人員應(yīng)學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)和甄別分析方法的合理性，領(lǐng)會(huì)方法學(xué)驗(yàn)證各指標(biāo)設(shè)置的目的，提高實(shí)驗(yàn)操作水平，并在觀察到異常現(xiàn)象后，分析其產(chǎn)生的原因，從而找到解決的方法。
